Neuer Ansatz zur Lösung des protein-Strukturen aus winzigen Kristallen: Technik öffnet die Tür zum Studium von unzähligen hart-zu-kristallisieren-Proteinen in Gesundheit und Krankheit

Mit Hilfe von x-Strahlen, zu offenbaren, die auf atomarer Skala 3-D-Strukturen von Proteinen geführt hat unzählige Fortschritte im Verständnis, wie diese Moleküle arbeiten in Bakterien, Viren, Pflanzen, und Menschen — und geleitet hat, die Entwicklung von Präzisions-Medikamenten zur Bekämpfung von Krankheiten wie Krebs und AIDS. Aber viele Proteine können nicht angebaut werden in Kristalle groß genug für Ihre atomanordnung entschlüsselt werden. Um diese Herausforderung zu bewältigen, haben Wissenschaftler des US Department of Energy ‚ s (DOE) Brookhaven National Laboratory und Kollegen an der Columbia University haben einen neuen Ansatz entwickelt, der Lösung von protein-Strukturen aus winzigen Kristallen.

Die Methode beruht auf der einzigartigen sample-handling, signal-Extraktion und Daten-Montage-Ansätze, und einer beamline in der Lage mit Schwerpunkt der intensiven x-Strahlen am Brookhaven National Synchrotron Light Source II (NSLS-II) – ein DOE Office of Science Benutzer Einrichtung-zu einem Millionstel-meter-Punkt, etwa ein fünfzigstel der Breite eines menschlichen Haares.

„Unsere Technik wirklich die Tür öffnet, um den Umgang mit mikrokristalle, die zuvor unzugänglich, einschließlich schwierig zu kristallisieren Zell-Oberflächen-Rezeptoren und anderen Membranproteinen, flexible Proteine, und viele komplexe menschliche Proteine,“ sagte Brookhaven-Labor Wissenschaftler Qun Liu, der entsprechende Autor der Studie, die veröffentlicht wurde am 3. Mai 2019, in IUCrJ, journal of the International Union of Crystallography.

Entschlüsselung von protein-Strukturen

Protein-Kristallographie wurde eine dominante Methode zur Lösung von protein-Strukturen seit 1958, Verbesserung im Laufe der Zeit als x-ray-Quellen gewachsen sind leistungsfähiger, so dass mehr präzise Struktur-Ermittlungen. Zum bestimmen einer protein-Struktur, die die Wissenschaftler Messen, wie x-Strahlen, wie diejenigen, die an NSLS-II beugen, oder abprallen der Atome in einem geordneten Kristallgitter, das aus vielen Kopien der gleichen protein-Molekül alle gekleidet die gleiche Weise. Das Beugungsmuster enthält Informationen darüber, wo sich die Atome befinden. Aber es ist nicht ausreichend.

„Nur die Amplituden der gebeugten x-ray „Wellen“ aufgezeichnet werden, auf den Detektor, aber nicht deren Phasen (das timing zwischen den Wellen),“ sagte Liu. „Beide sind erforderlich, um die Rekonstruktion eines 3-D-Struktur. Dies ist der sogenannte kristallographische phasenproblem.“

Crystallographers haben dieses problem gelöst, durch das sammeln von Daten aus phase eine andere Art von Streuung, bekannt als anomale Streuung. Anomale Streuung tritt auf, wenn die Atome, die schwerer sind als ein protein Hauptbestandteile Kohlenstoff, Wasserstoff und Stickstoff absorbieren und re-emittieren einige der x-Strahlen. Dies geschieht, wenn die x-ray-Energie liegt in der Nähe der Energie, die von jenen schweren Atome absorbieren. Wissenschaftler manchmal künstlich einfügen schweren Atomen wie Selen oder Platin in das protein für diesen Zweck. Aber Schwefel-Atome, die natürlich erscheinen in der gesamten protein-Moleküle, produzieren auch solche Signale, wenn auch schwächer. Obwohl diese anomale Signale zu schwach sind, einen großen Kristall hat in der Regel genügend Kopien des proteins mit genug Schwefel-Atome, um Sie messbar. Das gibt den Wissenschaftlern die phase erforderlichen Informationen zum ermitteln der Lage der schwefelatome und übersetzen die Beugungsmuster in eine volle 3-D-Struktur.

„Sobald Sie wissen, die Schwefel-Positionen, können Sie die Berechnung der Phasen für die anderen protein-Atome, weil die Beziehung zwischen dem Schwefel und den anderen Atomen fixiert ist,“ sagte Liu.

Aber der winzige Kristalle, die per definition nicht haben, dass viele Kopien des proteins von Interesse. Also anstatt sich für Beugung und phase Informationen aus wiederholen Sie die Kopien eines proteins in einem einzigen großen Kristall, Brookhaven/Columbia-team eine Methode entwickelt, um Messungen aus vielen winzigen Kristallen, und stellen dann die kollektiven Daten.

Winzige Kristalle, große Ergebnisse

Behandeln die kleinen Kristalle, die das team entwickelt sample-Gitter gemustert mit micro-sized Brunnen. Nach dem Gießen Lösungsmittel enthält mikrokristalle über die gut-mount-Netze, die Wissenschaftler, entfernt das Lösungsmittel und erstarrte Kristalle, die gefangen wurden auf die Gitter.

„Wir haben immer noch eine Herausforderung, obwohl, weil wir nicht sehen können, wo sich die kleinen Kristalle sind auf unser Netz“, sagte Liu. „Um das herauszufinden, verwendeten wir microdiffraction an NSLS-II Frontier Microfocusing Makromolekulare Kristallographie (FMX) – beamline, um den überblick im gesamten Gitter. Scan-Zeile um Zeile, wir können herausfinden, wo die Kristalle versteckt sind.“

Wie Martin Fuchs, der lead-beamline scientist an der FMX, erklärte, „Die FMX-beamline konzentrieren können, die volle Intensität des Lichtstrahls nach unten zu einer Größe von einem Mikrometer, oder ein Millionstel meter. Wir können fein-Kontrolle der Strahl-Größe entspricht die Größe der Kristalle — fünf Mikrometer im Fall des aktuellen Experiments. Diese Fähigkeiten sind entscheidend, um das beste signal“, sagte er.

Wuxian Shi, ein weiterer FMX-beamline-Wissenschaftler darauf hingewiesen, dass „die erhobenen Daten in der grid-Erhebung enthält Informationen über die Kristalle“ Ort. Darüber hinaus können wir auch sehen, wie gut jeder Kristall beugt, was uns ermöglicht, zu wählen nur die besten Kristalle für die Sammlung von Daten.“

Die Forscher waren dann in der Lage zu manövrieren, dem Probenhalter, um jede kartiert microcrystal von Interesse in die Mitte des precision x-ray beam für die Sammlung von Daten.

Sie verwendet die niedrigste Energie zur Verfügung, an der beamline-abgestimmt, zu nähern, so nah wie möglich Schwefel-Atome “ absorption der Energie — und gesammelt anomale Streuung von Daten.

„Die meisten kristallographische beamlines nicht erreichen konnte, der Schwefel absorption edge für optimierte anomale Signale“, sagte co-Autor Wayne Hendrickson von der Universität von Columbia. „Zum Glück, NSLS-II ist einer der weltweit führenden synchrotron-Lichtquelle bietet helle x-Strahlen, die ein breites Spektrum von x-ray-Energie. Und auch wenn unsere Energie-Ebene leicht über die ideale absorption der Energie für Schwefel, erzeugt es die anomalen Signale, die wir benötigen.“

Aber der Wissenschaftler hatte noch einige Arbeit zu tun, diese zu extrahieren wichtige Signale und montieren Sie die Daten aus vielen kleinen Kristallen.

„Wir sind eigentlich immer Tausende Daten“, sagte Liu. „Früher haben wir über 1400 mikrokristalle, jeder mit seinen eigenen Daten. Wir haben, um all die Daten aus, die mikrokristalle zusammen.“

Sie hatte auch zum herausfiltern von Daten aus Kristallen, die beschädigt wurden durch die Intensive x-Strahlen oder hatte leichte Unterschiede in der atomanordnung.

„Ein einziges microcrystal nicht beugen Röntgenstrahlen ausreichend für die Struktur der Lösung vor Schäden, die durch die x-Strahlen“, sagte Sean McSweeney, stellvertretender photon division Direktor und Programm manager des Strukturellen Biologie-Programm an NSLS-II. „Dies gilt insbesondere bei Kristallen nur wenige Mikrometer, die Größe von etwa einer bakteriellen Zelle. Wir mussten die Rechnung für das Schaden-und Kristallstruktur Variabilität, so dass Sie nicht verzerren unsere Ergebnisse.“

Sie erreicht diese Ziele mit einer ausgefeilten multi-step-workflow-Prozess, durchforstete die Daten, Ausreißer verworfen, die möglicherweise verursacht wurden durch die Strahlung beschädigt oder nicht kompatibel Kristalle, und schließlich extrahiert, die anomale Streuung Signale.

„Dies ist ein wichtiger Schritt“, sagte Liu. „Wir entwickelten ein Computer-Verfahren, um sicherzustellen, dass nur kompatible Daten wurden zusammengeführt in einer Weise auszurichten, die einzelnen mikrokristalle aus Beugungsmuster. Das gab uns die erforderliche signal-zu-Rausch-Verhältnisse für die Struktur-Bestimmung.“

Anwendung der Technik

Diese Technik kann verwendet werden, um zu bestimmen, die Struktur eines proteins, das nachweislich schwer zu kristallisieren, um eine große Größe. Dazu gehören Zell-Oberflächen-Rezeptoren, die es ermöglichen, Zellen der fortgeschrittenen Lebensformen wie Tiere und Pflanzen zu spüren, und reagieren auf die Umgebung um Sie herum durch releasing-Hormone, übertragung von Nerven-Signale oder die Abgabe von verbindungen im Zusammenhang mit Zellwachstum und-Immunität.

„Anpassung an die Umwelt durch die evolution, die diese Proteine sind formbar und haben eine Menge nicht-einheitlichen Veränderungen,“ sagte Liu. „Es ist schwer zu bekommen eine Menge wiederholen Sie die Kopien in einem Kristall, weil Sie nicht packen.“

Bei Menschen, die Rezeptoren sind gemeinsame Ziele für Drogen, so dass die Kenntnis Ihrer vielfältigen Strukturen könnte helfen, die Entwicklung neuer, zielgerichteter Medikamente.

Aber die Technik ist nicht darauf beschränkt, nur kleine Kristalle.

„Die Methode, die wir entwickelt handhaben kann, kleine protein-Kristalle, aber es kann auch verwendet werden, für jede Größe protein Kristalle, alle Zeit, die Sie brauchen, um zu kombinieren die Daten von mehr als einer Probe“ Liu sagte.